Labs projeta Cas13 para simplificar a identificação do coronavírus – ScienceDaily

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Um método projetado baseado em CRISPR que encontra RNA do SARS-CoV-2, o vírus que causa o COVID-19, promete tornar os testes para essa e outras doenças rápidos e fáceis.

Colaboradores da Rice University e da University of Connecticut projetaram ainda mais o sistema CRISPR-Cas13 de edição de RNA para aumentar seu poder para detectar quantidades mínimas do vírus SARS-CoV-2 em amostras biológicas sem a demorada etapa de extração e amplificação de RNA necessária para teste de PCR padrão-ouro.

A nova plataforma foi muito bem-sucedida em comparação com a PCR, encontrando 10 de 11 positivos e nenhum falso positivo para o vírus em testes em amostras clínicas diretamente de zaragatoas nasais. Os pesquisadores mostraram que sua técnica encontra sinais de SARS-CoV-2 em attomolar (10-18) concentrações.

O estudo liderado pelo engenheiro químico e biomolecular Xue Sherry Gao na Escola de Engenharia George R. Brown de Rice e pelos pesquisadores de pós-doutorado Jie Yang de Rice e Yang Song de Connecticut aparece na Nature Chemical Biology.

Cas13, como seu primo mais conhecido Cas9, faz parte do sistema pelo qual as bactérias naturalmente se defendem contra fagos invasores. Desde sua descoberta, o CRISPR-Cas9 foi adaptado por cientistas para editar genomas de DNA vivos e mostra grande promessa para tratar e até curar doenças.

E pode ser usado de outras maneiras. O Cas13 por si só pode ser aprimorado com RNA guia para encontrar e cortar sequências de RNA alvo, mas também para encontrar “colateral”, neste caso, a presença de vírus como o SARS-CoV-2.

“A proteína Cas13 projetada neste trabalho pode ser facilmente adaptada a outras plataformas previamente estabelecidas”, disse Gao. “A estabilidade e a robustez das variantes Cas13 projetadas as tornam mais adequadas para diagnósticos no local de atendimento em áreas de configuração de poucos recursos quando máquinas de PCR caras não estão disponíveis.”

Yang disse que o Cas13 do tipo selvagem, extraído de uma bactéria, Leptotrichia wadei, não pode detectar o nível attomolar do RNA viral dentro de um período de 30 a 60 minutos, mas a versão aprimorada criada na Rice faz o trabalho em cerca de meia hora e detecta SARS -CoV-2 em concentrações muito mais baixas do que os testes anteriores.

Ela disse que a chave é um loop de grampo flexível e bem escondido perto do local ativo do Cas13. “Está no meio da proteína perto do sítio catalítico que determina a atividade do Cas13”, disse Yang. “Como o Cas13 é grande e dinâmico, foi um desafio encontrar um site para inserir outro domínio funcional.”

Os pesquisadores fundiram sete domínios de ligação de RNA diferentes ao loop, e dois dos complexos foram claramente superiores. Quando encontrassem seus alvos, as proteínas fluoresciam, revelando a presença do vírus.

“Podemos ver que o aumento da atividade foi cinco ou seis vezes maior que o Cas13 do tipo selvagem”, disse Yang. “Esse número parece pequeno, mas é bastante surpreendente com uma única etapa de engenharia de proteínas.

“Mas isso ainda não foi suficiente para a detecção, então mudamos todo o ensaio de um leitor de placas de fluorescência, que é bastante grande e não está disponível em configurações de poucos recursos, para um sensor eletroquímico, que tem maior sensibilidade e pode ser usado para pontos diagnóstico de cuidados”, disse ela.

Com o sensor de prateleira, Yang disse que a proteína projetada era cinco ordens de magnitude mais sensível na detecção do vírus em comparação com a proteína do tipo selvagem.

O laboratório quer adaptar sua tecnologia a tiras de papel como as dos testes caseiros de anticorpos COVID-19, mas com sensibilidade e precisão muito maiores. “Esperamos que isso torne os testes mais convenientes e com menor custo para muitos alvos”, disse Gao.

Os pesquisadores também estão investigando a detecção aprimorada dos vírus Zika, dengue e Ebola e biomarcadores preditivos para doenças cardiovasculares. Seu trabalho pode levar a um diagnóstico rápido da gravidade do COVID-19.

“Vírus diferentes têm sequências diferentes”, disse Yang. “Podemos projetar RNA guia para direcionar uma sequência específica que podemos detectar, que é o poder do sistema CRISPR-Cas13”.

Mas como o projeto começou assim que a pandemia se instalou, o SARS-CoV-2 foi um foco natural. “A tecnologia é bastante receptiva a todos os alvos”, disse ela. “Isso o torna uma opção muito boa para detectar todos os tipos de mutações ou diferentes coronavírus”.

“Estamos muito entusiasmados com este trabalho como um esforço combinado de biologia estrutural, engenharia de proteínas e desenvolvimento de dispositivos biomédicos”, acrescentou Gao. “Eu aprecio muito todos os esforços dos membros e colaboradores do meu laboratório.”

Os co-autores do artigo são Rice pesquisador de pós-doutorado Xiangyu Deng, graduação Jeffrey Vanegas e estudante de pós-graduação Zheng You; estudantes de pós-graduação Yuxuan Zhang e Zhengyan Weng da Universidade de Connecticut; a supervisora ​​de microbiologia Lori Avery e Kevin Dieckhaus, professor de medicina da UConn Health; Yi Zhang, professor assistente de engenharia biomédica da Universidade de Connecticut; e Yang Gao, professor assistente de biociências da Rice.

Xue Sherry Gao é Professor Assistente Ted N. Law de Engenharia Química e Biomolecular na Rice.

A National Science Foundation (2031242, 2103025), a Welch Foundation (C-1952, C-2033-20200401) e o Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR190046) apoiaram a pesquisa.



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